Откриване на генетични промени при ракови заболявания
218Лабораториите по молекулярна генетика използват множество различни методи за откриване на разнообразието от генетични промени, които са терапевтично значими при ракови заболявания. За солидни тумори повечето от тези тестове се извършват върху ракови тъкани фиксирани във формалин, съдържащи парафин (FFPE).
Основните видове генетични тестове са три основни класа:
- анализират ДНК
- анализират експресията на иРНК
- анализират експресията на протеини
Резултатите от анализи на ДНК, иРНК и протеини могат да имат различна значимост. Въпреки, че и трите класа тестове могат да анализират една и съща цел в тъкан клиничното значение може да варира. Например при рак на белия дроб EGFR ДНК мутации предсказват много добра чувствителност към епидермален растежен фактор рецептор (Epidermal Growth Factor Receptor - EGFR) тирозин киназни инхибитори докато нивата на брой копия на EGFR ДНК, нивата на експресия на иРНК или нивата на протеини имат малка или нулева предсказуема стойност.
Генетичен код
Генетичната информация се предава от една клетка на друга под формата на дезоксирибонуклеинова киселина (ДНК). ДНК кодира информационна рибонуклеинова киселина (и РНК), която след това се транскрибира в протеин.
Градивните елементи на ДНК включват четири нуклеотида включително аденозин (A), цитозин (C), гуанин (G) и тимидин (T). Градивните елементи на протеините са 20 аминокиселини. Човешкият геном се състои от около 3 милиарда нуклеотида. От тези 3 милиарда нуклеотиди само ~5% кодират гени, които се превеждат в протеини в клетката. Генът допълнително се разделя на екзони, които съдържат действителната информация използвана при кодирането на протеиновия синтез и интрони, които са сегменти между екзони, които се отстраняват преди протеинът да бъде транслиран (интроните не съдържат кодираща информация).
Нуклеотидите са организирани в трибуквени кодови думи наречени кодони. Всеки кодон кодира една аминокиселина. Генетичният код е целият набор от 64 трибуквени кода, които превръщат кодоните в аминокиселини. Генетичният код тъй като има 64 кодона и само 20 аминокиселини повече от един кодон може да кодира една и съща аминокиселина. Някои кодони се наричат стоп кодони, защото вместо да кодират аминокиселина те информират клетката коя аминокиселина е последната в протеина.
Мутациите променят нормалния модел на последователност на ДНК. Соматичните мутации възникват при ракови заболявания, но не се откриват в съответстващи нормални тъкани от същия пациент.
Точкови мутации
Точковите мутации (като EGFR L858R при рак на белия дроб) са резултат от единични нуклеотидни замествания. Ако тези мутации се появят в екзони те могат да бъдат или синонимни (кодираната аминокиселина остава същата) или несинонимни (кодираната аминокиселина се променя).
За откриване на повтарящи се точкови мутации директното дидезоксинуклеотидно (Sanger) секвениране е златен стандарт. Въпреки това този метод обикновено включва анализ на един ген наведнъж и има ниска чувствителност като най-често изисква повече от 25% туморни клетки в дадена проба.
Разработени са анализи за откриване на десетки мутации едновременно като се използва или масспектрометрия или капилярна електрофореза. И двата анализа разчитат на множество стъпки на PCR (полимеразна верижна реакция).
Обикновено се използва FISH анализ за „разпадане“ на двойна проба където се използват две сонди белязани с различни флуоресцентни цветове, които хибридизират от двете страни на гена, който се проследява.
Ако генът е непокътнат двете сонди са толкова близо, че се припокриват и цветовете се сливат, но ако генът е пренареден двете сонди стават необичайно разделени. Използването на сонди за разпадане може да открие дали е налице пренареждане, но ограничението е, че генът „партньор“ слят с пренаредения ген няма да бъде известен. Други методи (като RT-PCR (реверсивна транскриптазна полимеразна верижна реакция)) са необходими за идентифициране на специфичното генно сливане.
Генна делеция/неповтарящи се мутации
За разлика от онкогените, които обикновено се активират от специфични повтарящи се събития като генно сливане, генна амплификация или мутации в няколко критични позиции ("горещи мутации") инактивирането на туморни супресорни гени става чрез много по-хетерогенен спектър на генетични промени за които тестването е много по-трудоемко и сложно. Поради това клиничното тестване на архивиран туморен материал за промени в туморния супресорен ген все още не се извършва рутинно или широко.
Имунохистохимията с протеин-специфични антитела може да се използва за откриване на липса на протеинова експресия. Директното секвениране може да се използва за търсене на мутации в цял ген.
Промени базирани на иРНК
иРНК могат да присъстват или да липсват при ракови заболявания. Когато присъстват те понякога могат да бъдат „свръхекспресирани“ (експресирани на по-високи нива от нормалното). Нивата на иРНК се откриват в туморната тъкан с помощта на процес наречен количествена RT-PCR (реверсивна транскриптазна полимеразна верижна реакция).
Мутациите могат да бъдат открити и с помощта на иРНК. Като цяло тъй като иРНК са много по-малко стабилни в сравнение с ДНК те често са твърде разградени за анализ в клинични проби и по този начин е по-лесно да се използва ДНК за откриване на мутации. Едно изключение от това е, че точната последователност на известни генни сливания се открива по-лесно на ниво иРНК.
Промени на базата на протеини
Имунохистохимия
Протеините могат да присъстват или да отсъстват при ракови заболявания. Когато присъстват те понякога могат да бъдат „свръхекспресирани“ (експресирани на по-високи нива от нормалното). Протеините се откриват с помощта на процес наречен имунохистохимия (IHC). IHC включва „оцветяване“ на тъкани с антитела, които разпознават специфични протеини представляващи интерес. Докато такива специфични антитела са налични и надеждни IHC може да се използва за откриване на мутирали протеини или липсата им в туморна тъкан.
Нивата на протеин обаче могат или не могат да бъдат клинично значими. Например при рак на белия дроб мутациите на EGFR ДНК, но не и нивата на EGFR протеин от IHC предсказват чувствителността към инхибиторите на тирозин киназата на EGFR.
Проучване предполага, че високите нива на експресия на EGFR измерени чрез IHC могат да предскажат отговора на цетуксимаб (анти-EGFR антитяло) плюс химиотерапия в сравнение само с химиотерапията.
https://www.mycancergenome.org